Вновь собор был отстроен по заказу царя Федора Иоанновича и его жены царицы Ирины Годуновой в 1587—1588 годах; как говорит летописец, он был сделан «больши старого». Юго-западный угол старого храма, где располагались наиболее чтимые захоронения, по мнению специалистов, при перестройке не потревожили и включили в новый храм. На плане Кремля 1б00-х годов мы видим стройное здание с мощным пятиглавием и большими полукруглыми закомарами. Круглое окно в центральной закомаре схоже с таким же окном Архангельского собора. Вознесенский собор имел три апсиды, четыре внутренних столпа; стены его по-ренессансному членились на три яруса карнизами и на три прясла двухъярусными пилястрами. В качестве образца для нового храма вновь послужил Архангельский собор Кремля: прообразом для церкви-усыпальницы великих княгинь и цариц стал храм-усыпальница их мужей. Возможно, Борис Годунов, пока еще царский шурин, вдохновитель замысла нового собора, желая упрочить свое положение неофициального правителя страны, хотел, чтобы его родство с царицей было зримо и монументально воплощено в Кремле; отсюда и прототип в виде «царского собора».

В Вознесенском соборе не были повторены резные детали и классический ордер собора-прототипа, но схема членения фасадов была точно воспроизведена. Очень изящная обработка стен собора как бы маскировала их двухметровую толщину. Покрыт собор первоначально был по закомарам; четырехскатная крыша, видная на старых фотографиях, явно поздняя. Собор конца XVI века был первым и одним из ярких памятников так называемой «годуновской школы», которые очень высоко ценятся историками русской архитектуры. Композиция этих храмов отличается особой стройностью, боковые главы смещены к центральной, поставленной на постамент. На фасадах используется ордерная система, причем художественные качества «годуновских» соборов заставляют исследователей говорить о чрезвычайно высоком профессиональном уровне мастеровпостроить каменнуе против образца какова в Москве в Кремле в девичьем Вознесенском монастыре. а какова Вознесенская церковь мерою кругом и в вышину и тому посланы. к вам образцы и сметные росписи и чертежи», — гласит царская грамота.